一、實驗目的
土壤浸提液組分復雜、可溶性微生物代謝產(chǎn)物含量偏低、可供檢測的樣品體積有限，屬于典型微量待測體系。本操作規(guī)范利用芬蘭Kibron?Epsilon微量樣品檢測模式、Delta?8高通量微孔板微量進樣，完成低體積土壤浸提發(fā)酵上清的動態(tài)表面張力、油水界面張力測定，檢測土壤微生物胞外多糖、生物表面活性劑、脂類代謝物的界面活性；針對微量體系容易出現(xiàn)的樣品損耗、雜質(zhì)污染、水分蒸發(fā)等問題建立標準化前處理與上機流程，保障低含量代謝物測試數(shù)據(jù)可靠。
二、實驗前期準備
1.儀器與耗材準備
核心儀器：搭載微量樣品檢測組件的Kibron?Epsilon動態(tài)界面張力儀、Kibron Delta?8高通量表面張力分析儀；配件包含微型Wilhelmy合金探針、小型石英微量樣品池、低吸附96?well微孔板、帕爾貼恒溫基座、探針火焰灼燒清潔組件、配套檢測軟件。
輔助設備：超凈工作臺、高速冷凍離心機、0.22 μm低吸附水系濾膜、水浴恒溫槽、超聲清洗儀、微量移液槍、低吸附微量離心管。
實驗耗材：供試土壤樣品、無菌液體培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液、酸堿調(diào)節(jié)劑、超純水、無水乙醇、異丙醇。
2.儀器預處理規(guī)范
1. 張力儀器提前通電預熱30 min，設置檢測溫度25 ℃，全程溫控波動控制在±0.2 ℃。
2. 微型合金探針每次測試前使用丁烷火焰充分灼燒，燒掉粘附的胞外聚合物、土壤有機質(zhì)殘留物，冷卻之后開展純水零點校準；純水表面張力穩(wěn)定處于71.8~72.2 mN/m，基線連續(xù)30 min波動小于0.2 mN/m才可啟動微量檢測。
3. 微量樣品池、微孔板依次異丙醇擦拭、無水乙醇沖洗、超純水多次潤洗之后氮氣吹干；微量體系極易被手上油脂、塵埃污染，操作全程只能捏住容器外壁。
4. 儀器放置減震臺面，閉合防風防護罩，減少微量試液水分快速蒸發(fā)造成代謝物濃縮。
3.土壤浸提液制備、微生物培養(yǎng)以及微量待測液預處理
1. 土壤浸提原液制備：稱取風干土壤，按照固液比例加入無菌純水，恒溫震蕩浸提，離心之后獲取上層土壤浸提液，作為微生物培養(yǎng)液基質(zhì)。
2. 土壤源微生物富集培養(yǎng)：使用土壤浸提液配制培養(yǎng)液，接種土著微生物，恒溫搖床振蕩發(fā)酵；設置空白對照組為未經(jīng)微生物培養(yǎng)的無菌土壤浸提液；每組準備多份平行發(fā)酵體系。
3. 微量上清獲取：吸取發(fā)酵菌液，8000 r/min常溫離心15 min，沉淀菌體、土壤細小顆粒雜質(zhì)，小心吸取上層澄清發(fā)酵浸提上清；單次待測樣品體積只保留需要檢測的微量規(guī)格。
4. 上清精細化預處理
試液肉眼含有細小懸浮顆粒時選用低吸附水系濾膜緩慢過濾；溶液清澈通透直接跳過過濾步驟，防止微量疏水代謝物吸附損耗；
將微量離心管放置恒溫水浴平衡至檢測溫度；低功率超聲脫氣5 min，清除試液內(nèi)部微型氣泡；
微量試液禁止劇烈顛倒搖晃，避免產(chǎn)生氣泡消耗氣?液界面活性物質(zhì)；樣品現(xiàn)處理現(xiàn)上機，微量體系揮發(fā)速度快，常溫存放時長不可超過3 h。
4.預實驗基線驗證
取空白無菌土壤浸提液上機進行90 min動態(tài)張力檢測，確認空白浸提液有機質(zhì)不會造成表面張力大幅度浮動；選取一份發(fā)酵后的微量浸提上清預測試，確認微型探針潤濕狀態(tài)正常，可以捕捉微生物代謝物帶來的張力下降。
三、標準化上機檢測完整操作流程
1.Kibron?Epsilon微量樣品池精細檢測
1. 使用微量移液槍吸取足量微量脫氣浸提上清，緩慢注入微型石英樣品池，加注過程貼著杯壁緩慢流入，杜絕氣泡生成；出現(xiàn)氣泡則廢棄試液重新制備。
2. 將微量樣品池安放至恒溫帕爾貼基座，關閉防風罩靜置12 min，試液溫度和氣?液界面達到平衡。
3. 在軟件開啟微量模式，啟動動態(tài)表面張力采集，檢測時長設置90 min，記錄完整吸附動力學曲線，讀取吸附誘導時長、張力下降速率、平衡表面張力；如需測定疏水代謝物乳化性能，添加微量原油測試油水界面張力。
4. 單次測試結(jié)束之后升起微型探針，火焰灼燒清理土壤有機質(zhì)和黏性胞外代謝物殘渣，倒掉微量廢液，樣品池清洗晾干之后進行下一組樣品。
2.Delta?8微孔微量進樣高通量篩查
1. 使用移液槍向96孔低吸附微孔板每一個孔位加入50 μL微量土壤浸提待測液；微孔板蓋上蓋板減少水分揮發(fā)。
2. 微孔板放置恒溫載板恒溫平衡30 min。
3. 開啟儀器自動檢測程序，每個微孔重復檢測三次，取平均值作為最終界面張力結(jié)果。
4. 整板測試結(jié)束之后高溫灼燒清潔探針陣列；每隔10個樣品孔放置空白土壤浸提對照孔，實時監(jiān)測基線漂移。
3.平行樣品質(zhì)控標準
同一平行土壤浸提三份微量試液測得平衡界面張力差值大于0.5 mN/m，樣品需要重新脫氣復測；全部微量樣品檢測溫度、界面靜置時長、探針下降參數(shù)保持統(tǒng)一。
4.實驗收尾和儀器養(yǎng)護
檢測完畢之后反復灼燒微型探針，清除頑固土壤腐殖質(zhì)、多糖殘留物；微量樣品池、微孔板采用溫水浸泡去除有機質(zhì)，乙醇擦拭晾干。導出全部浸提樣品動態(tài)張力曲線與參數(shù)，探針放置干燥防塵環(huán)境存放。
四、數(shù)據(jù)處理和代謝物界面活性解析
1. 提取各項動力學參數(shù)：界面吸附誘導時間、表面張力下降速率、平衡氣?液表面張力、油水界面張力。
2. 和空白無菌土壤浸提液進行對照，扣除土壤原生有機質(zhì)帶來的張力干擾，計算微生物代謝產(chǎn)物造成的表面張力下降幅度。
3. 對比不同培養(yǎng)時長、不同土壤組別浸提液張力參數(shù)，篩選可以分泌高活性表面活性代謝物的土著微生物；還可探究pH、鹽度對微量代謝物界面特性帶來的影響。
五、微量體系專屬關鍵控制要點
1. 微型探針極易粘附土壤腐殖質(zhì)、黏性胞外聚合物，每一次微量樣品檢測之后必須灼燒除雜；檢測順序由低活性樣品至高活性樣品，規(guī)避殘留物污染微量試液。
2. 嚴控檢測溫度恒定，微量體系溫度波動會加快水分揮發(fā)，快速濃縮微生物代謝物，帶來巨大檢測誤差。
3. 微量試液體積少、極易揮發(fā)，上機之前再打開離心管，縮短敞口放置時長。
4. 全程做好除氣泡操作，微量體系內(nèi)部微小氣泡便會消耗大部分表面活性分子，讓吸附動力學曲線失真。
5. 試液清澈時省去過濾步驟，微量的脂肽、糖脂類疏水代謝物極易吸附在濾膜內(nèi)壁，造成測得表面張力偏高，誤判代謝物活性。
6. 關閉防風防護罩，空氣流動會加速微量試液蒸發(fā)，同時擾動氣?液界面，干擾最終檢測結(jié)果。
